Água Alcalina e Longevidade: Um Estudo Murino

Massimiliano Magro,1 Livio Corain,2 Silvia Ferro,1 Davide Baratella,1 Emanuela Bonaiuto,1
Milo Terzo,1 Vittorino Corraducci,1 Luigi Salmaso,2 e Fabio Vianello1

1 Departamento de Biomedicina Comparada e Ciência de Alimentos, Universidade de Pádua, 35020 Legnaro, Itália

2 Departamento de Gestão e Engenharia, Universidade de Pádua, 36100 Vicenza, Itália

 

Correspondências devem ser dirigidas a Fabio Vianello; Fabio.vianello@unipd.it

 

Recebido em 7 de março de 2016; Revisado em 26 de abril de 2016; Aceito em 11 de maio de 2016

 

Editor Acadêmico: Hajime Nakae

 

Copyright © 2016 Massimiliano Magro et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite uso, distribuição e reprodução sem restrições em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.

O efeito biológico do consumo de água alcalina é objeto de controvérsia. O presente trabalho apresenta um estudo de sobrevivência de 3 anos em uma população de 150 camundongos, e os dados foram analisados com o modelo de tempo de falha acelerada (AFT). A partir do segundo ano de vida, os gráficos de sobrevivência não paramétricas sugerem que os camundongos hidratados com água alcalina apresentaram maior sobrevivência do que os camundongos de controle. Curiosamente, a análise estatística revelou que a água alcalina proporciona maior longevidade em termos de "fator de envelhecimento da desaceleração", pois aumenta as funções de sobrevivência quando comparado com o grupo de controle; nomeadamente, os animais pertencentes à população tratada com água alcalina tiveram uma vida útil maior. O exame histológico de rins, intestinos, coração, fígado e cérebro de camundongos revelou que não surgiram diferenças significativas entre os três grupos, indicando que nenhuma patologia específica resultou em correlação com o consumo de água alcalina. Esses resultados fornecem um resumo informativo e quantitativo dos dados de sobrevivência como função da rega com água alcalina de modelos de camundongo com vida longa.

1.Introdução

A água alcalina, muitas vezes referida como água ionizada alcalina (AKW), está comercialmente disponível e é principalmente proposta para suplementação eletrolítica durante transpiração intensiva. Estudos iniciais sobre modelos animais relataram que a suplementação de água alcalina pode exercer efeitos positivos sobre a melhoria e o desenvolvimento do peso corporal na prole [1, 2]. Mesmo os marcadores bioquímicos foram analisados, sugerindo que a ingestão de água ionizada alcalina pode causar elevação da atividade metabólica. Em particular, a hipercaliemia foi observada em camundongos de 15 semanas e as alterações patológicas da necrose no músculo miocárdico foram encontradas [3].

Mais recentemente, estudos foram realizados em água alcalina reduzida (ARW), referente à água eletrólise produzida a partir de minerais, como magnésio e cálcio, que é caracterizada por hidrogênio supersaturado, alto pH e potencial redox negativo. Esta água funcional rica em hidrogênio foi introduzida como uma estratégia terapêutica para promoção da saúde e prevenção de doenças [4].

Verificou-se que a água alcalina e eletrolisada exerce um e feito supressivo sobre os níveis de radicais livres em organismos vivos, resultando em prevenção de doenças [5]. Vários efeitos biológicos, como ações antidiabéticas e antioxidantes [4], efeitos protetores do DNA [6] e atividades de estimulação do crescimento [2], foram documentados.

Embora tenha sido relatada uma variedade de funções bioativas, o efeito da água alcalina na vida útil e longevidade in vivo ainda é desconhecido. A alcalinização animal mostrou ser bem tolerada e aumentar a resposta tumoral à quimioterapia metronômica, bem como a qualidade de vida em animais de estimação com câncer avançado [7]. Portanto, realizamos um estudo baseado em experiências de taxa de sobrevivência, que desempenham um papel central na pesquisa em envelhecimento e geralmente são realizadas para avaliar se intervenções específicas podem alterar o processo de envelhecimento e a vida útil em modelos animais.

2.Materiais e Métodos

Os efeitos biológicos da água alcalina foram avaliados em uma população selecionada de 150 camundongos (CD1, por Charles River, Oxford, Reino Unido). Camundongos sem patógenos foram comprados e colocados em uma instalação de criação específica. Nenhum outro animal estava presente na sala. O contato com cuidadores de animais foi minimizado para alimentação e rega. A população foi dividida em 3 grupos, cada um composto por 50 indivíduos, da seguinte forma:

 

(I) Grupo A: 50 camundongos convencionalmente alimentados e hidratados com água alcalina produzida pelo Ionizador de Água (mod. NT010) da Asiagem (Itália). O Ionizador de Água é um dispositivo de tratamento doméstico para produzir água potável alcalina.

(ii) Grupo B: 50 camundongos convencionalmente alimentados e hidratados com água alcalinizada obtida por diluição de uma solução alcalina concentrada (AlkaWater da Asiagem, Itália). AlkaWater é uma solução alcalina concentrada para a preparação de água potável alcalina.

(iii) Grupo C: 50 camundongos convencionalmente alimentados e hidratados (grupo controle) com água da torneira. O abastecimento local de água foi avaliado semanalmente para garantir a ausência de toxinas e patógenos. Os valores de pH estavam no intervalo de 6,0-6,5.

 

Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com a lei italiana sobre animais de experimentação e foram aprovados pelo Comitê de Ética para Experimentos de Animais da Universidade de Pádua e o Ministério da Saúde da Itália (Aut. N° 39ter 2011). Foram feitos esforços para minimizar o sofrimento animal.

 

2.1. Exame Histológico. Os camundongos idosos tratados foram amostrados pós-morte e submetidos a exame histológico. Os animais pertencentes às populações tratadas com água alcalina, A e B, foram sacrificados após 24 meses e comparados a camundongos tratados com água da torneira. As amostras de rins, intestino, coração, fígado e cérebro foram fixadas em 10% de formalina tampada neutra, e  4 cortes transversais foram analisados por microscopia óptica.

 

2.2. Análise Estatística. Para investigar a influência biológica da água alcalina na longevidade do camundongo, empregamos o modelo acelerado de tempo de falha (AFT) [8], o que permite explorar formalmente o possível efeito nas curvas de sobrevivência do tratamento de três níveis aplicado, ou seja, examinar o papel da associação de grupo como uma covariável vida útil. Como uma alternativa mais robusta aos modelos de risco proporcional comumente utilizados, como o modelo Cox, o uso de modelos AFT é aconselhado no campo da análise de sobrevivência quando o objetivo é investigar se uma covariável pode afetar o tempo de vida de uma maneira que o ciclo de vida pode passar mais ou menos rapidamente. Na verdade, enquanto um risco proporcional avalia o fato de que o efeito de uma conversão ao longo do tempo, o modelo AFT assume que o efeito de uma covariável é acelerar ou desacelerar a vida.

A relevância do modelo AFT para estudos biomédicos já foi reconhecida na literatura [8]. Com uma referência mais específica à questão do envelhecimento, Swindell [9] observou que algumas manipulações genéticas tinham um efeito multiplicativo sobre a sobrevivência, que eram bem caracterizadas pelo "fator de desaceleração" do modelo AFT . Além disso, Swindell [9] argumentou também que o modelo AFT deve ser utilizado mais amplamente na pesquisa sobre envelhecimento, uma vez que fornece ferramentas úteis para maximizar a visão obtida de estudos experimentais de sobrevivência de camundongos.

Para realizar todos os cálculos, aplicamos uma abordagem de análise de sobrevivência paramétrica usando uma classe de modelos de distribuição AFT de 3 parâmetros implementados no software estatístico Minitab, versão 17.2.1 [10]. Mais especificamente, empregamos três tipos de distribuições aleatórias, ou seja, log-logística, log-normal e Weibull generalizada.

3.Introdução

O experimento consistiu em um período inicial de aclimatação de 15 dias. Após a aclimatação, os animais (50, grupo A) foram hidratados com água alcalina (pH 8,5), obtida pelo Ionizador de Água (Asiagem, Itália), e os animais do grupo B (50) foram hidratados com água alcalinizada a pH 8,5 por uma solução alcalina concentrada (AlkaWater da Asiagem, Itália) por 15 dias. Os animais do Grupo C (50), grupo de controle, foram hidratados com o abastecimento de água local. Este período foi identificado para acostumar gradualmente os animais tratados com água alcalina. No final do segundo período de aclimatização, os animais do grupo A e B foram hidratados com água alcalina a pH 9,5 (com o Ionizador de Água e o AlkaWater da Asiagem, Itália), enquanto os animais do grupo C foram hidratados com água de torneira local.

Após o primeiro ano, os indivíduos mais agressivos foram transferidos para outras gaiolas dentro do mesmo grupo e um protocolo de enriquecimento ambiental foi empregado para diminuir a hiperatividade. Este fenômeno foi observado especialmente em animais dos grupos A e B.

A Tabela 1 relatou estatísticas básicas sobre sobrevivência de camundongos de animais tratados e controlados.

Em relação ao grupo A, animais (50) foram hidratados com água alcalina (pH 8,5), obtidos pelo Ionizador de Água (Asiagem, Itália). Quanto ao grupo B, os animais (50) foram hidratados com água alcalinizada a pH 8,5 por uma solução alcalina concentrada (AlkaWater da Asiagem, Itália) durante 15 dias. Em relação ao grupo C, animais (50), grupo controle, foram hidratados com o abastecimento de água local.

Um primeiro olhar sobre os dados experimentais é fornecido na Figura 1, onde riscos de risco e gráficos de sobrevivência não paramétricas parecem sugerir que, mesmo que não apareça diferença macroscópica, a partir do segundo ano de vida, os camundongos regados com ionizador de água alcalina e aqueles tratados com AlkaWater dominaram os camundongos de controle.

Para explorar o possível efeito de diferentes tratamentos, ou seja, para examinar o papel da associação de grupo na longevidade, aplicamos uma abordagem de análise de sobrevivência paramétrica usando uma classe de distribuições de sobrevivência de 3 parâmetros que representam modelos AFT de tempo de falha acelerado flexíveis. Em primeiro lugar, usando a estatística de bondade de ajuste de Anderson-Darling, comparamos três distribuições de sobrevivência específicas, ou

 

Figura 1: Gráficos de risco e sobrevivência não paramétricas por nível de tratamento. Grupo A: animais (50) foram hidratados com água alcalina (pH 8,5), obtida pelo Ionizador de Água (Asiagem, Itália). Grupo B: animais (50) foram hidratados com água alcalinizada com pH 8,5 por uma solução alcalina concentrada (AlkaWater da Asiagem, Itália) durante 15 dias. Grupo C: animais (50), grupo controle, foram hidratados com o abastecimento local de água.

 

seja log-logística (AD = 6.397), log-normal (AD = 6.519) e Weibull generalizada (AD = 6.447). Uma vez que o melhor ajuste foi demonstrado pelo modelo de log-logística, adotámos este como modelo final de distribuição de sobrevivência. As linhas retas nos gráficos QQ de distribuição log-logística (Figuras 2 (a) e 2 (b)) indicam que esta distribuição fornece um ajuste adequado aos nossos dados de sobrevivência.

Finalmente, ao incluir nosso tratamento como covariável, realizamos uma análise de distribuição paramétrica cujos resultados foram representados graficamente na Figura 3.

A partir do segundo ano de vida, vale a pena notar que ambos os grupos tratados com água alcalina denotam uma curva de risco decrescente ao longo do tempo, enquanto que a curva correspondente para o grupo de controle está aumentando monotonicamente. Para comparar os níveis de tratamento de maneira mais formal, a análise proposta forneceu valores adequados. Uma vez que os valores relacionados nas hipóteses nulas de igualdade de parâmetros de localização, escala e limiar foram, respectivamente, inferiores a 0,001 (para ambos os locais e escalas) e 0,634 (para limites) em um nível de significância de 5%; podemos afirmar que há evidências experimentais suficientes para concluir que o tratamento afeta significativamente a longevidade dos camundongos; em particular, a água alcalina proporciona um benefício à longevidade em termos de "fator de envelhecimento da desaceleração", pois diminui as funções de risco quando comparado com o grupo controle. Observe que o efeito do tratamento não pode ser diretamente relacionado a nenhum dos três parâmetros de distribuição. De qualquer forma, usando os parâmetros estimados, seria possível fornecer uma estimativa para o efeito de cada tratamento na sobrevivência: estabelecendo o tempo de sobrevivência de referência para 1000, 1200 e 1400 dias, a Tabela 2 resume as probabilidades estimadas de probabilidade de ponto e 95% de intervalo por cada nível de tratamento.

Como observação final, deve-se notar que, mesmo que nossa análise paramétrica de sobrevivência AFT fosse realizada usando a distribuição log-logística, nossas conclusões são consistentes com os resultados obtidos na distribuição Weibull generalizada enquanto que, via distribuição log-normal, nenhum efeito significativo foi encontrado.

 

3.1. Exame Histológico. Não houve diferenças significativas no exame histológico entre os três grupos. Em todas as amostras examinadas, o tecido renal foi caracterizado por um infiltrado Intersticial linfoplasmocítico leve a moderado e poucas alterações glomerulares ocasionais como redução do tamanho glomerular e aumento do espaço de Bowman (Figura 4).

O diagnóstico final foi a nefropatia progressiva crônica leve para os três grupos de ratos analisados.

O exame microscópico do fígado revelou um padrão nodular multi-tifocal do parênquima e degeneração hidropônica citoplasmática hepatocelular leve a moderada com binucleação multifocal em todos os animais explorados (Figura 5).

A anisocariose leve a moderada foi a alteração mais relevante, com poucos núcleos pleomórficos e pseudoinclusões intranucleares frequentes e a cariomegalia. Um infiltrado perivascular leve específico estava ocasionalmente presente. O diagnóstico final foi hepatopatia difusa leve a moderada com hiperplasia multifocal do tipo hiperplásica.

Figura 2: Gráficos QQ usando o modelo de distribuição log-logística de 3 parâmetros. (A) Quantis de tempo de sobrevivência do tratamento A (eixo vertical) versus quantis de tempo de sobrevivência do tratamento B (eixo horizontal); (b) quantis de tempo de sobrevivência do tratamento B (eixo vertical) versus quantis de tempo de sobrevivência do tratamento C (eixo horizontal).

O parênquima pulmonar mostrou áreas multifocais suaves de espessamento intersticial dos septos interalveolares devido a congestão moderada e infiltrado misto celular leve (Figura 6). As áreas de enfisema leve foram detectadas na periferia do parênquima. O diagnóstico final foi atelectasia multifocal muito leve e enfisema vicário leve.

Ao mesmo tempo, não foram observadas alterações histológicas histopatológicas relevantes no intestino (Figura 7), cérebro e coração.

4.Discussão

O presente trabalho apresenta um estudo de sobrevivência de 3 anos em uma população de 150 camundongos e os dados foram analisados com o modelo de tempo de falha acelerada (AFT). A análise estatística Kaplan-Meier dos 

dados de sobrevivência indica a possibilidade de um efeito positivo da água alcalina na vida útil do camundongo e o modelo AFT permitiu avaliar as diferenças a partir do segundo ano das curvas de sobrevivência. Esses resultados fornecem um resumo informativo e quantitativo dos dados de sobrevivência como função da irrigação com água alcalina em modelos de camundongos de vida longa. Deve-se ressaltar que, do ponto de vista da pesquisa sobre envelhecimento, esta abordagem estatística apresenta propriedades atraentes e fornece ferramentas valiosas para a análise da sobrevivência. A observação de tecidos de animais falecidos foi realizada para a avaliação do estado dos órgãos internos a serem comparados com análises semelhantes de animais não tratados. As lesões renais observadas na histologia foram específicas e comuns para os três grupos de animais. A nefropatia progressiva crônica foi descrita como uma alteração normal de envelhecimento camundongos [11, 12]. Nos nossos casos, os animais não apresentaram nenhum sinal clínico de nefropatia ou qualquer outra evidência histológica de doença renal específica e atribuímos lesões ao processo de envelhecimento [11, 12].

Os fígados examinados também foram afetados por lesões típicas de indivíduos maduros, como os nódulos hiperplásticos. Além disso, alterações bem conhecidas do envelhecimento foram individualizadas nos hepatócitos, como a cariomegalia, o pleomorfismo nuclear e os cistos de pseudoinclusões [11, 12].

Figura 5: Fígado, mudança de envelhecimento. Citoplasma não homogêneo, abundante em hepatocélulas, binucleação (centro), núcleos de tamanho variável e cisto de pseudoinclusão nuclear (seta). Hematoxilina e Eosina.

Figura 6: Pulmão, atelectasia leve. Espessamento intersticial multifocal muito leve dos septos alveolares associado ao congestionamento e ao aumento celular leve. Hematoxilina e Eosina.

Figura 7: Intestino: Secção longitudinal do duodeno com vilosidades uniformemente delgadas e alongadas. Hematoxilina e Eosina.

5.Conclusões

Um estudo de sobrevivência de 3 anos em uma população de 150 camundongos foi realizado para investigar o efeito biológico do consumo de água alcalina. Em primeiro lugar, os gráficos não paramétricos de risco e de sobrevivência sugerem que os camundongos hidratados com água alcalina estavam em número muito maior que os camundongos de controle. Em segundo lugar, os dados foram analisados com o modelo de tempo de falha acelerada (AFT), inferindo que um benefício na longevidade, em termos de "fator de desaceleração de envelhecimento", foi correlacionado ao consumo de água alcalina. Finalmente, o exame histológico de rins, intestino, coração, fígado e cérebro dos camundongos foi realizado para verificar o risco de doenças correlacionadas com a irrigação alcalina. Nenhum dano significativo, além de mudanças de envelhecimento, surgiu; os órgãos dos animais tratados com água alcalina resultaram ser bastante superposicionáveis aos controles, aprofundando o debate sobre o consumo de água alcalina por seres humanos.

 

Interesses Concorrentes

Os autores declaram que não existem interesses financeiros concorrentes.

 

Reconhecimentos

Este artigo é dedicado à memória de Tommaso Nicoletti. Os autores agradecem a Rocco Palmisano por suas ideias originais e suporte. Os autores agradecem a Asiagem (Itália) pelo apoio parcial e Ludovico Scenna, Carlo Zatti e Silvano Voltan pela contribuição científica e profissional.

 

Referências

 

[1] T.Watanabe andW. Shirai, “Influence of alkaline ionized water on reproductive functions in the rat,” International Journal of Fertility and Sterility, vol. 35, pp. 748–751, 1990.

[2] T. Watanabe, “Effect of alkaline ionized water on reproduction in gestational and lactational rats,” Journal of Toxicological Sciences, vol. 20, no. 2, pp. 135–142, 1995.

[3] T. Watanabe, Y. Kishikawa, and W. Shirai, “Influence of alkaline ionized water on rat erythrocyte hexokinase activity andmyocardium,” Journal of Toxicological Sciences, vol. 22,no. 2, pp. 141–152, 1997.

 

[4] D. Jin, S. H. Ryu, H. W. Kim et al., “Anti-diabetic effect of alkaline-reduced water on OLETF rats,” Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, vol. 70, no. 1, pp. 31–37, 2006.

[5] K. Hanaoka, D. Sun, R. Lawrence, Y. Kamitani, and G. Fernandes, “The mechanism of the enhanced antioxidant effects against superoxide anion radicals of reduced water produced by electrolysis,” Biophysical Chemistry, vol. 107, no. 1, pp. 71–82, 2004.

[6] S. Shirahata, S. Kabayama, M. Nakano et al., “Electrolyzedreduced water scavenges active oxygen species and protects DNA from oxidative damage,” Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 234, no. 1, pp. 269–274, 1997.

[7] E. P. Spugnini, S. Buglioni, F. Carocci et al., “High dose lansoprazole combined with metronomic chemotherapy: a phase I/II study in companion animals with spontaneously occurring tumors,” Journal of Translational Medicine, vol. 12, p. 225, 2014.

[8] D. Collett, Modelling Survival Data in Medical Research, Texts in Statistical Science, Chapman & Hall/CRC, 3rd edition, 2014.

[9] W. R. Swindell, “Accelerated failure time models provide a useful statistical framework for aging research,” Experimental Gerontology, vol. 44, no. 3, pp. 190–200, 2009.

[10] Minitab, Minitab_, (version 17.2.1, 2013), http://www.minitab .com.

[11] E. F. McInnes, Background Lesions in Laboratory Animals. A Color Atlas, Saunders Elsevier, 2012.

[12] D. H. Percy and S.W. Barthold, Pathology of Laboratory Rodents and Rabbits, Iowa State Press, Ames, Iowa, USA, 2nd edition, 2001.

Figura 3: Resultados do gráfico de distribuição usando o modelo de log-logística de 3 parâmetros. Grupo A: animais (50) foram hidratados com água alcalina (pH 8,5), obtida pelo Ionizador de Água (Asiagem, Itália). Grupo B: animais (50) foram hidratados com água alcalinizada com pH 8,5 por uma solução alcalina concentrada (AlkaWater da Asiagem, Itália) durante 15 dias. Grupo C: animais (50), grupo controle, foram hidratados com o abastecimento local de água.

Figura 4: Rim, uma nefropatia crônica específica. Infiltrado intersticial focal, principalmente linfocítico (vertical), e um glomérulo esclerótico (meio direito). Hematoxilina e Eosina.